مرکز آزمایش و تحقیقات ژنتیک میبد

سیتوژنتیک مولکولی

CGH array

کاربرد آزمایش کاریوتیپ به روش مرسوم قدیمی در قیاس با کاریوتیپ مولکولی (CGH Array )  همانند استفاده از یک نقشه قدیمی از کشور‌ها در مقایسه با نرم‌افزارهای نقشه یابی چون   Google earth است.  در یک نقشه قدیمی تنها خطوط مرزی بین کشورها و حدفاصل بین آنها مشخص است. اما نرم‌افزار نقشه‌یاب بررسی دقیق‌تر و نزدیک‌تر در سطح خیابان‌ها و کوچه‌‌ها را ممکن پذیر می‌سازد. در این حالت اگر ژنی حذف یا اضافه شده باشد به سرعت شناسایی می‌شود. 

  CGH Array چیست؟

CGH Array تکنیکی با قدرت تفکیک بالا برای بررسی حذف‌ها و یا اضافه شدگی‌های در کل ژنوم و شناسایی عدم تعادل کروموزومی است. این آزمایش را کاریوتیپ مولکولی می‌نامند و به ویژه برای شناسایی علت عقب ماندگی‌های ذهنی و یا ناهنجاری‌های مادرزادی کاربرد دارد. این آزمایش  رفته رفته به عنوان آزمایش روتین در آزمایشگاه‌های سیتوژنتیک جایگزین روش‌های قدیمی مطالعه کروموزمی و تعیین کاریوتیپ می‌شود.

اساس این آزمایش مقایسه هیبرید شدگی ژنوم‌ در میکروآرایه‌ها است ( microarray Comparative Genomic Hybridization) (CGH Array) . قدرت تفکیک بالای این تکنیک آن را  جهت بررسی‌های بالینی بسیار مناسب می‌سازد.

در روش‌های مرسوم قدیمی بسیاری از ریز حذف‌های کروموزمی که اندازه‌ای در حدود 3 تا 5 مگاباز دارند شناسایی نمی‌شوند زیرا در این روش‌ها از میکروسکوپ استفاده می‌شود و قدرت تفکیک و تشخیص حذف‌ها و اضافه شدگی به قدرت تفکیک میکروسکوپ محدود می‌شود. درنتیجه تغییرات بسیار کوچک‌تر از قدرت تشخیص میکروسکوپ که به تغییرات غیر مرئی با میکروسکوپ موسومند شناسایی نمی‌شوند.

 به این دلیل است که  تکنیک CGH Array که قادر به شناسایی حذف‌ها و اضافه شدگی‌های در حد 5 تا 10 کیلو باز است را  تکنیک میکروآرایه یا ریزآرایه می‌نامند.

 این تغییرات بسیار کوچک کروموزمی می‌توانند پیامد بالینی به همراه داشته باشند. بر اساس تحقیقات جدید تخمین زده می‌شود این تغییرات عامل 17 درصد عقب‌ماندگی‌های سندرمی و غیرسندرمی باشند.

علاوه بر قدرت تفکیک بالا ، بی نیاز بودن از تکنیک‌های زمان‌بر کشت سلولی باعث بالا رفتن سرعت انجام این روش می‌شود.

برتری آزمایش CGH Array نسبت به تکنیک‌های چون FISH و QF-PCR نیز جامع بودن آزمایش CGH Array است. در تکنیک FISH نیز ریز حذف‌های کروموزمی شناسایی می‌شوند. اما این تکنیک زمانی که علائم بالینی احتمال بروز یک اختلال کروموزمی را مطرح‌ می‌کند به کار می‌رود و صرفاً یک ژن و یا بخش از پیش شناخته ژنوم مورد بررسی قرار می‌گیرد. در حالیکه آزمایش CGH Array بدون توجه به علائم بالینی امکان بررسی تعداد بسیار زیادی از حذف‌ها و اضافه شدگی‌ها را تنها با انجام یک آزمایش امکان پذیر می‌سازد.

در حدود بیش از 70 بیماری ناشی از تفاوت در تعداد کپی‌های کروموزمی (Copy Number Variation-CNV ) شناسایی شده است. ٱزمایش CGH Array به شناسایی این بیماری‌ها کمک می‌کند. البته بسیاری از این تفاوت‌ها در جمعیت‌ها طبیعی است و عاملی برای بیماری نیست. وجود این CNVها‌ی باصطلاح پلی‌مورفیک گاهی تحلیل و بررسی نتایج حاصل از آزمایش CGH Array  را مشکل می‌سازد و در نتیجه در برخی مواقع لازم است نمونه خون والدین فرد بیمار نیز مورد بررسی قرار بگیرد.

نقطه ضعف روش CGH Array نیز شناسایی نشدن جابه‌جایی‌های کروموزمی متعادل است. در این وضعیت هیچ بخشی از کروموزوم‌ها حذف یا اضافه نمی‌شود. و تنها جابه‌جایی بخش‌هایی از کروموزم عامل بیماری است از این رو CGH Array قادر به تشخیص آن نیست.

 
روش انجام آزمایش CGH Array

برای انجام آزمایش CGH Array نمونه DNA فرد مورد نظر با نمونه DNA کنترل مورد مقایسه قرار می‌گیرد.

 به این منظور این نمونه‌های DNA توسط رنگ‌های فلورسانس متفاوت (در تصویر دو رنگ قرمز و سبز به ترتیب برای نمونه مورد آزمایش و نمونه کنترل) رنگ آمیزی می‌شود.

اسلاید‌ها و یا آرایه‌های میکروسکوپی حاوی چاهک‌های بسیار کوچک که در هر کدام قطعه کوتاهی از DNA وجود دارد نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد. در تصویر شمایی از این اسلاید‌ها را مشاهده می‌کنید.

  نمونه کنترل و نمونه مورد آزمایش روی این اسلاید‌ها ریخته شده و مدت زمان و شرایط لازم برای اتصال و هیبرید شدن قطعات DNA فراهم می‌شود.
در قسمت‌هایی از DNA که تفاوتی میان نمونه کنترل و نمونه مورد آزمایش وجود ندارد هر دو رنگ قرمز و سبز به اندازه مساوی است و به رنگ زرد مشاهده می‌شوند. اما در بخش‌هایی که در نمونه مورد آزمایش حذف شدگی وجود داشته باشد رنگ نمونه کنترل (رنگ سبز) بیشتر مشاهده می‌شود و در قسمت‌هایی که مضاعف شدگی وجود داشته باشد رنگ نمونه مورد آزمایش بیشتر (رنگ قرمز) بیشتر مشاهده می‌شود.

 

 

 

 

 

 

 نمونه مورد نیاز
آزمایش CGH Array روی نمونه‌های خونی از کودکان یا بزرگسالان انجام می‌گیرد. جهت تشخیص پیش از تولد نیز بررسی نمونه‌ مایع آمنیون و یا پرزهای جفتی جنینی انجام می‌گیرد.

موارد کاربرد آزمایش CGH Array 
آزمایش CGH Array یک ابزار مناسب برای شناسایی عدم تعادل کروموزمی در افرادی با عقب ماندگی‌های ذهنی و یا ناهنجاری‌های متعدد مادرزادی است.
 همچنین در شناسایی علل ناشناخته مشکلات ذهنی و رفتاری و علائمی چون صرع و تشنج می‌توان از این آزمایش بهره برد.
 آزمایش CGH Array تغییرات ژنی را در 15 درصد کودکانی که مشکلات یادگیری و تکاملی دارند و بررسی‌های سیتوژنتیکی معمول نقص کروموزمی خاصی را در آنان شناسایی نکرده مشخص کرده است.
با شناسایی ناحیه تغییر یافته از ژنوم و ژن تغییر یافته توسط آزمایش CGH Array پزشک می‌تواند پیش بینی از وضعیت بیمار در طول زمان به دست آورد و جهت گیری صحیحی برای انجام اقدامات درمانی اتخاذ کند.
در صورت شناسایی تغییر ژنتیکی در یک فرد می‌توان پدر و مادر و یا دیگر اعضای خانواده را از لحاظ ناقل بودن بررسی کرد و در صورت نیاز برای فرزندان آینده تشخیص پیش از تولد انجام داد.

برتری‌های آزمایش CGH Array 

-        تمامی 46 کروموزم انسان در یک آزمایش بررسی می‌شوند.

-        حساس‌تر و دقیق‌تر از روش‌های کاریوتیپ مرسوم است.

-        تشخیص انجام گرفته بر اساس این آزمایش فرد را از انجام سایر آزمایش‌ها بی‌نیاز می‌سازد.

-        در این آزمایش محل دقیق حذف شدگی‌ها و اضافه شدگی‌ها در ژنوم شناسایی می‌شود.

-        این آزمایش به شناسایی نقاط شکست در عدم تعادل‌‌های کروموزمی شناخته شده کمک می‌کند. 

تجهیزات :
عمده ترین تجهیزات CGH array شامل اسکنر و سیستم هیبریداسیون و هود بدون ازن می باشد.
 
 
 
 
 
این سیستم علاوه بر کاربرد در زمینه سیتوژنتیک مولکولی قابلیت استفاده در سایر روش های میکرواری مثل تعیین ژنوتیپ و بررسی بیان ژن و .... را نیز دارد و زمینه گسترده ای را جهت پژوهش و تشخیص فراهم می سازد.
 
 
تکنیک FISH و کاربردهای آن در تشخیص اختلالات ژنتیک
 
 
تکنیک هیبریداسیون در محل توسط Gall and Pardue و همچنین Jone و همکاران در سال ۱۹۶۹ ابداع گردید. این روش مکان یابی ژن ها یا توالی های RNA یا DNA را به مستقیم روی کروموزوم ها امکان پذیر ساخته است. در تکنیک FISH اسید های نوکلئیک تک رشته ای (معمولا DNA و گاهی اوقات RNA) با یکدیگر برهمکنش داده می شوند به  طوری که کمپلکس ها یا هیبرید هایی را با ایجاد مولکول هایی با تشابه زیاد یا توالی های مکمل را تشکیل دهند. پس از هیبریداسیون اسید های نوکلئیک، میزان همسانی توالی ها تعیین می شود. در نتیجه، توالی های خاص شناسایی شده و روی کروموزوم های خاص مکان یابی می شوند به طور خلاصه، این تکنیک جزو اولین تکنیک های  هیستوشیمیایی است که شامل استفاده از دسته های مختلفی از رنگ های طبیعی و مصنوعی برای رنگ آمیزی ساختار های سلولی و اجتماعات درون سلولی می باشد. این ترکیبات عموما غیر اختصاصی بوده و برای دسته بندی مو لکول های خاص مانند پروتین ها، اسید های نوکلئیک، لیپیدها و کربوهیدرات ها به کار می روند. این  روش، مستلزم هیبریداسیون کاوشگر اسید نوکلئیک با اسید نوکلئیک مورد نظر در محل (in situ) است.
 مراحل اصلی تکنیک FISH
در تکنیک FISH ، توالی های DNA که مکان یابی شده اند ابتدا به منظور ایجاد کاوشگرها با مواد فلورسنت نشاندار می شوند. سپس کاوشگر با کروموزوم های تعیین شده در بافر هیبریداسیون ترکیب می شوند. پس از این تیمار و دناتوره شدن DNA به رشته های مجزا، کاوشگر و محل تعیین شده برای اتصال مجدد (Re-annealing) ، آماده می شوند. کاوشگر به طور اختصاصی با مکان مکمل خود بر روی کروموزوم، باند می شود. پس از شستشو و شناسایی با گزارشگر فلورسنت، سیگنال فلورسنت در محل هیبرید کاوشگر به طور جداگانه قابل مشاهده و تشخیص با میکروسکوپ فلورسنت است. به عبارت دیگر می توان گفت که هیبریداسیون در محل یک روش بسیار حساس برای تشخیص فعالیت ژن ها به طور مستقیم در سلول یا بافت های تثبیت شده است. سلول، بافت یا جنین با فرمامید تثبیت می شود. عامل تثبیت کننده از شکستن مولکول ها جلوگیری می کند و آنها را در محل مورد نظر برای آنالیز نگه می دارد. مراحل این تکنیک شامل:
۱- ثابت کردن نمونه ها در روی اسلایدها،
۲- هیبرید کردن با اولیگونوکلئوتید هایی که با مواد فلورسنت آغشته شده اند،
 ۳- رنگ آمیزی با رنگ های غیر اختصاصی مانند DAPI
۴- اضافه کردن مواد شستشو دهنده،
۵- مشاهده زیر میکروسکوپ فلورسنت
کاوشگر های اسید نوکلئیک که به طور مستقیم با رنگ های فلورسنتی نشاندار شده اند، برای شناسایی توالی های هدف بزرگ
مورد استفاده قرار می گیرند. در این روش، زمان کمتری مورد نیاز است اما شدت سیگنال های تولید شده پایین تر می باشد.
با به کار بردن لایه هایی از معرف های شمیایی شناساگر می توان شدت سیگنال ها و همچنین حساسیت را افزایش داد. با استفاده از چنین ابزار هایی، شناسایی توالی های تک نسخه ای روی کروموزوم ها با کاوشگر های کوتاه تر از ۰/۸ کیلو بازامکان پذیر می گردد. به لحاظ اندازه نیز کاوشگرها می توانند طولی در حدود چندین جفت باز (اولیگونوکلئوتید ها) تا بیشتر از یک مگا باز داشته باشند. انواع مختلف کاوشگر ها می توانند برای شناسایی انواع مشخصی از DNA به کار روند. توالی های DNA تکراری ناشی از تکثیر با PCR، اولیگونوکلئوتید های اختصاصی برای عناصر تکراری یا عناصر تکراری کلون شده برای شناسایی دسته هایی از توالی های DNA تکراری در نواحی هتروکروماتینی یا نواحی سنترومری کروموزوم های مجزا مورد استفاده قرار می گیرند. بالعکس، برای شناسایی توالی های هدف تک لوکوسی ،cDNA  ها یا قطعاتی از DNA ژنومی کلون شده با اندازه ای در حدود ۱۰۰ کیلو باز تا ۱ مگا باز می توانند به کار روند. برای شناسایی کروموزوم های خاص یا نواحی کروموزومی ،cDNA های خاص هر کروموزوم به عنوان کاوشگر به منظور تشخیص کروموزوم های مجزا از مجموعه کامل کروموزومی، مورد استفاده قرار می گیرند. برای انجام هیبریداسیون موفق عوامل زیر دخیل هستند:
۱- طول کاوشگر
۲- درجه حرارت
۳- غلظت نمک و pH  و فرمامید
 کاربردهای FISH
۱- کاوشگر برای توالی های خاص DNA
۲- مقایسه نواحی خاص در بسیاری از گونه ها و مکان یابی ژن های خاص روی کروموزوم
۳- آنالیز ساختمانی ژنوم
۴ – شناسایی غلظت های بالای جفت بازها (یعنی مکان هایی که به لحاظ باندهای A-T یا C-G غنی باشند)
۵- کمک به تهیه نقشه های ژنی ، فیزیکی و ستیوژنتیکی و تشخیص فعالیت ژن ها
۶- تعیین سطح پلوئیدی
۷ – تشخیص مکان یک ناحیه ازDNA یا RNA
8- تشخیص جابجائی های کروموزومی
9- تشخیص حذف یا اضافه شدن ها در نواحی مختلف کروموزومی
مرکز تحقیقات ژنتیک میبد تجهیزات و دانش فنی لازم جهت استفاده از روش FISH  را جهت ارائه خدمات تشخیصی و پژوهشی دارا می باشد و در صورت نیاز و یا درخواست مراجعین می تواند با خریداری پروب های مورد نظر به ارائه خدمات بپردازد.
 
 
 
 

بازدید مجازی از مرکز

در دست ساخت...

برای ورود به تور مجازی کلیک کنید »

آمار بازدیدکنندگان

آنلاین : 1

امروز : 9

کل : 116793